Ce centre de référence contribue à la surveillance épidémiologique nationale de l’évolution et des caractéristiques des infections invasives à Streptococcus agalactiae chez l’homme, dont les formes graves survenant dans la période périnatale.
1, Avenue de l’Hôpital, Bât. B23, étage +2, 4000 Liège
Une des missions principales du Centre National de Référence (CNR) Streptococcus agalactiae, aussi identifié comme Streptocoque du groupe B de Lancefield (GBS), est de contribuer à la surveillance épidémiologique nationale de l’évolution et des caractéristiques des infections invasives chez l’homme et tout particulièrement des formes graves survenant dans la période périnatale.
Cette surveillance comprend également l’étude de la sensibilité des GBS aux agents antimicrobiens.
Dans le cadre de cette activité, tous les laboratoires de biologie clinique de Belgique (et du Grand-Duché du Luxembourg) sont invités à envoyer au CNR chaque isolat de GBS d’origine humaine associé à une infection invasive en l’accompagnant d’une fiche spécifique permettant le recueil de renseignements cliniques du patient, d’information sur le prélèvement et dans certains cas, de caractéristiques de la souche isolée en termes de virulence ou de sensibilité aux agents antimicrobiens.
Le CNR est accrédité BELAC sous l’ISO 15189 (BELAC 128 MED).
Le centre de référence GBS possède une collection importante de bactéries identifiées en tant que S. agalactiae. De manière générale, toutes les souches envoyées au CNR sont conservées dans une souchothèque après caractérisation. Toutes souches reçues dans le cadre d'études de colonisation sont également conservées.
Le CNR GBS assure une activité de conseil auprès des cliniciens et microbiologistes confrontés à des patients chez qui on suspecte une infection à GBS. Pour toute question, le personnel du CNR est disponible par email ou par téléphone (Voir coordonnées de contact).
Le CNR met régulièrement en place des activités de surveillance.
Ce test repose sur une inoculation directe sur milieux solides sélectifs et différentiels (gélose Granada, gélose chromogénique, gélose Columbia au sang + colistine et acide nalidixique), éventuellement précédée d'une nuit d'incubation dans un bouillon d'enrichissement sélectif tel que le bouillon de Lim. Il s'inscrit dans le cadre de surveillances épidémiologiques et microbiologiques, ou sert de méthode de référence pour la validation de nouvelles techniques ; il n'est pas réalisé par le CNR à des fins diagnostiques. Sa réalisation est soumise à une demande spécifique du CNR, dans le cadre d'un protocole de surveillance limitée ou de validation de nouveaux tests de diagnostic/milieux de culture.
L'échantillon est prélevé par frottis vagino-rectal (ou autre site selon protocole spécifique), idéalement à l'aide d'un flocked swab avec milieu de transport (Amies ou Stuart par exemple). Il doit être conservé moins de 24 heures à température ambiante, ou moins de 48 heures s'il est réfrigéré à 2-8°C, puis transporté le plus rapidement possible à température ambiante, dans les 48 heures suivant le prélèvement, selon les règles d'étiquetage et de transport applicables aux échantillons infectieux (récipient/emballage étanche).
Un échantillon est rejeté en cas de fuite du milieu de transport, d'absence d'identification, de champs obligatoires du formulaire de demande incomplètement remplis, ou de conditions manifestement inappropriées de conservation ou de transport.
L'inoculation est réalisée 6 jours par semaine, avec un résultat disponible dans un délai de 10 jours ouvrables ; la communication des résultats suit le protocole d'étude spécifique.
L'identification des colonies isolées d'une sous-culture fraîche repose sur une ou plusieurs méthodes combinables : détection immunologique de l'antigène du groupe B par agglutination de latex (après extraction enzymatique), tests biochimiques, et spectrométrie de masse MALDI-TOF — dont les profils permettent aussi de comparer des souches d'un même sérotype. Ce test confirme l'identification des souches atypiques ou difficiles à identifier, des souches de SGB envoyées régulièrement au CNR pour typage capsulaire (CPS), confirmation de la CMI de la pénicilline, ou surveillance des infections invasives et des porteurs sains, ainsi que des souches issues d'études de validation de nouveaux tests ou milieux de culture. Il sert aussi à confirmer et comparer un ensemble de souches lors d'une suspicion d'épidémie, après contact avec le CNR.
Les souches peuvent être conservées une semaine à température ambiante ou réfrigérées à 2-8°C sur gélose au sang non sélective, ou congelées dans un milieu protecteur (lait écrémé, ou bouillon nutritif non sélectif + 10 % de glycérol). Le transport s'effectue via une sous-culture fraîche sur gélose au sang, une inoculation massive en profondeur en gélose nutritive, ou une sous-culture pure abondante sur écouvillon avec son milieu de transport, aussi rapidement que possible à température ambiante et dans les 72 heures suivant la préparation, selon les règles applicables aux échantillons infectieux (récipient/emballage étanche).
Un échantillon est rejeté s'il ne répond pas aux critères de sélection, en cas de fuite du milieu de transport, d'absence d'identification, de champs obligatoires incomplets sur le formulaire, ou de conditions de conservation/transport manifestement inappropriées.
Le délai d'identification est de 10 jours ouvrables : la confirmation des souches atypiques est réalisée 5 jours par semaine, celle des souches pour typage capsulaire ou surveillance par série, au moins une fois par semaine. Les résultats sont communiqués par courrier, voie électronique, ou selon les protocoles spécifiques de surveillance.
Dix polysaccharides capsulaires (CPS) sont actuellement décrits (Ia, Ib, II à IX), avec un très faible pourcentage de souches non typables. Le sérotypage détermine le phénotype exprimé par la capsule (via agglutination au latex), tandis que le génotypage détermine la présence des gènes codant le CPS (via 1 ou 3 PCR multiplex différentes). Un gène présent n'est pas nécessairement exprimé, et les conditions de croissance peuvent modifier la longueur et la quantité de CPS détectable. Le typage commence habituellement par le sérotypage, le génotypage n'étant réalisé qu'en cas de résultat négatif ou non concluant. La distribution des sérotypes variant selon la géographie, le type de maladie et l'âge du patient, sa surveillance s'impose dans la perspective d'une future vaccination. Le test vise ainsi à typer le CPS des souches envoyées au CNR à cette fin, des souches issues de la surveillance épidémiologique et microbienne des infections invasives à SGB et des porteurs sains, des souches liées à une épidémie suspectée, et des souches cultivées pour des validations techniques.
Les souches à envoyer régulièrement au CNR sont celles responsables d'infections invasives (infections néonatales, morts in utero, infections chez la patiente enceinte ou en dehors d'une grossesse), isolées d'hémoculture, de LCR, de liquide synovial ou d'un autre site normalement stérile ; pour les infections néonatales, la souche maternelle (frottis vagino-rectal ou lait maternel) doit si possible être jointe. En cas de suspicion d'infection grave, les souches d'urine, du tractus respiratoire inférieur ou de plaie peuvent aussi être envoyées, de même que les souches de porteurs sains à la demande du CNR, ou un ensemble de souches de patients différents en cas de suspicion d'épidémie. Les souches se conservent une semaine à température ambiante ou réfrigérées à 2-8°C sur gélose au sang non sélective, ou congelées dans un milieu protecteur (lait écrémé, ou bouillon nutritif non sélectif + 10 % de glycérol). Le transport — sous-culture fraîche sur gélose au sang, inoculation profonde en gélose nutritive, ou sous-culture pure abondante sur écouvillon — doit être aussi rapide que possible à température ambiante, dans les 72 heures suivant la préparation, selon les règles applicables aux échantillons infectieux (récipient/emballage étanche).
Un échantillon est rejeté hors critères de sélection, en cas de fuite du milieu de transport, d'absence d'identification, de champs obligatoires incomplets sur le formulaire, ou de conditions de conservation/transport manifestement inappropriées.
Le sérotypage est rendu en 10 jours ouvrables ; le génotypage en 1 à 4 semaines, par série au moins mensuelle. Les résultats sont communiqués par courrier ou voie électronique, et résumés dans le rapport annuel.
Ce test détermine les CMI de plusieurs classes d'agents antimicrobiens (bêta-lactames, macrolides, lincosamides, fluoroquinolones, tétracyclines, glycopeptides, gentamicine). Pour les bêta-lactames, la pénicilline est l'agent de référence pour la CMI, et le sous-ensemble de molécules/procédures recommandées pour détecter une sensibilité réduite évolue régulièrement ; pour le groupe macrolides-lincosamides, l'érythromycine et la clindamycine sont habituellement utilisées. Pour tout isolat présentant une sensibilité réduite à l'un de ces derniers, les mécanismes de résistance MLS sont identifiés par phénotype (test de synergie en diffusion à deux disques, Dtest) et par génotype (PCR détectant les gènes erm, modification de cible, et mef, efflux). Le test sert à confirmer ou déterminer la CMI de la pénicilline (sur demande explicite, ou en cas de sensibilité réduite détectée en laboratoire de routine), à approfondir l'investigation de toute souche confirmée avec une CMI pénicilline ≥ 0,25 mg/L (diamètre d'inhibition < 18 mm) ou un phénotype atypique de résistance à la clindamycine (clindamycine R, érythromycine S), ainsi qu'à analyser chaque année, sur les souches d'infections invasives et des sous-ensembles de comparaison — dont les porteurs sains et les souches régulièrement envoyées pour le typage du CPS —, l'évolution des profils de sensibilité aux antibiotiques, des types de résistance MLS (constitutive/inductible) et de la distribution des gènes correspondants, afin d'identifier l'émergence de nouveaux phénotypes ou génotypes. Les résultats sont résumés globalement ou stratifiés selon le type de patient (nouveau-nés, adultes en infection grave, isolats génitaux/rectaux de patients colonisés).
Les souches à envoyer régulièrement au CNR sont celles présentant une sensibilité réduite à la pénicilline (CMI ≥ 0,25 mg/L ou diamètre d'inhibition < 18 mm) ou un phénotype atypique de résistance à la clindamycine (clindamycine R, érythromycine S) — le résultat observé initialement devant être communiqué dans les deux cas. Elles se conservent une semaine à température ambiante ou réfrigérées à 2-8°C sur gélose au sang non sélective, ou congelées dans un milieu protecteur (lait écrémé, ou bouillon nutritif non sélectif + 10 % de glycérol). Le transport — sous-culture fraîche sur gélose au sang, inoculation profonde en gélose nutritive, ou sous-culture pure abondante sur écouvillon — doit être aussi rapide que possible à température ambiante, dans les 72 heures suivant la préparation, selon les règles applicables aux échantillons infectieux (récipient/emballage étanche).
Un échantillon est rejeté hors critères de sélection, en cas de fuite du milieu de transport, d'absence d'identification, de champs obligatoires incomplets sur le formulaire, ou de conditions de conservation/transport manifestement inappropriées.
La vérification ou confirmation d'une CMI (pénicilline ou autre agent) sur demande explicite, la détermination des CMI de surveillance et la détermination du phénotype de résistance MLS sont rendues en 2 à 5 jours ouvrables, ou par série au moins deux fois par an ; le génotypage MLS, lui, n'est réalisé que par série, au moins deux fois par an. Les résultats de confirmation de CMI sont communiqués par courrier ou voie électronique ; l'ensemble des résultats est résumé dans le rapport annuel.
Trois protéines pili spécifiques ancrées à la surface des streptocoques du groupe B ont été récemment décrites : PI-1, PI-2a et PI-2b. Certaines souches ne portent aucun des gènes correspondants, tandis que d'autres peuvent les héberger seuls ou en combinaison ; un gène présent n'est pas nécessairement exprimé. Les anticorps synthétisés contre ces protéines sont protecteurs contre l'infection néonatale et constituent des cibles antigéniques majeures pour les vaccins en développement, ce qui justifie la surveillance de leur distribution — laquelle varie géographiquement, selon le type de maladie et l'âge du patient. La présence de ces gènes, détectée par PCR multiplex, est typée sur les souches isolées de sites normalement stériles ou profonds lors d'une infection invasive et envoyées régulièrement au CNR pour typage du CPS et surveillance, sur les souches de porteurs sains dans le cadre d'un protocole spécifique de surveillance, ainsi que sur les ensembles de souches envoyées après contact avec le CNR en cas de suspicion d'épidémie.
Aucun envoi spécifique n'est nécessaire pour ce test : il est réalisé sur les souches de SGB déjà envoyées régulièrement au CNR. Les instructions de transport et les critères de rejet habituels ne s'appliquent donc pas.
Les résultats sont présentés dans le rapport annuel et peuvent être transmis individuellement sur demande spécifique.
La méthode MLST fait appel aux techniques modernes de biologie moléculaire pour un typage génétique par séquençage de régions d'environ 500 paires de bases provenant de 7 gènes ubiquitaires : adhP (alcool déshydrogénase), ATR (transporteur d'acides aminés), glcK (glucose kinase), glnA (glutamine synthétase), pheS (phénylalanine ARNt synthétase), sdhA (sérine déshydratase) et tkt (transkétolase). Les résultats du séquençage sont soumis à une base de données spécifique à S. agalactiae, qui attribue à la souche un code et un « sequence type » (ST). Cette technique est particulièrement utile chez les patients présentant une clinique virulente — le ST17 étant notamment souvent associé à une présentation extrême. Elle s'applique aux souches de SGB isolées de sites normalement stériles ou profonds lors d'une infection invasive et envoyées régulièrement au CNR pour typage du CPS et surveillance, aux souches de porteurs sains suivies dans le cadre d'un protocole spécifique, ainsi qu'aux ensembles de souches transmises après contact avec le CNR en cas de suspicion d'épidémie.
L'échantillon est transmis sous forme d'une sous-culture fraîche sur gélose au sang, d'une inoculation massive en profondeur en gélose nutritive, ou d'une sous-culture pure abondante récoltée sur écouvillon avec son milieu de transport, aussi rapidement que possible à température ambiante et dans les 72 heures suivant la préparation, selon les règles applicables aux échantillons infectieux (récipient/emballage étanche).
Un échantillon est rejeté hors critères de sélection, en cas de fuite du milieu de transport, d'absence d'identification, de champs obligatoires incomplets sur le formulaire, ou de conditions de conservation/transport manifestement inappropriées.
Le résultat est disponible en 1 à 4 semaines, réalisé par série ou sur demande spécifique. Les résultats sont communiqués par courrier ou voie électronique, et résumés dans le rapport annuel.
Les laboratoires de biologie clinique du CHU de Liège ont mis en place depuis de nombreuses années un système de qualité. Dans cette démarche qualité dans le service de microbiologie, le scope accrédité concernait spécifiquement certains secteurs d’activités comme la microbiologie moléculaire. Parallèlement, la même démarche a été mise en place en vue de l’accréditation des activités du CNR GBS : culture, méthodes d’identification, de typage des GBS ainsi que des méthodes de détermination de leur sensibilité aux agents antimicrobiens.
L’audit d’accréditation avec obtention du Certificat BELAC a eu lieu en mai 2013 (BELAC 128 MED).
